ARTÍCULO ORIGINAL

 

Evaluación genotóxica del aceite esencial y el extracto etanólico de  Piper elongatum Vahl

 

Genotoxic evaluation of essential oil and ethanolic extract of Piper elongatum Vahl

 

 

Ana Paula Jiménez Dasilba¹, Araceli Pillco Tito ², Ninoska Flores Quisbert¹, Eduardo Gonzáles Davalos¹, Paulia Bermejo Benito³

¹ UMSA - FCFB - Instituto de Investigación fármaco Bioquímicas. La Paz. Bolivia.
²Laboratorio de Mutagénesis del Centro de Ciencias Medio ambientales del CSIC-Madrid España. ³Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. Madrid, España.

Dirección para correspondencia: Eduardo Gonzáles Dávalos Ph.D. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Universidad Mayor de San Andrés, Av. Saavedra #2224, Miraflores, La Paz, Bolivia
Teléfono 2229021
Email: eduardo.gonzales@gmail.com

Recibido para publicación en: 7/11/11
Aceptado en 24/12/11

 

 

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RESUMEN 

Se realizó la evaluación genotóxica del aceite esencial y el extracto etanólico de Piper elongatum Vahl mediante la prueba in vivo de mutación y recombinación somática (SMART), que emplea a Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) como organismo experimental. Se utilizaron dos diferentes tipos de cruces con los marcadores genéticos flr³ y mwh: El cruce Estándar (ST) y el cruce de Alta Bioactivación (HB); como control positivo se empleó Mitomicina C (MMC). Los resultados obtenidos fueron analizados mediante el estadístico de Kastenbaum-Bowman (α =0,05), y sugieren que el extracto etanólico de Piper elongatum Vahl a concentraciones por debajo de 100mg/ml, así como el aceite esencial en concentraciones por debajo de 0.5% (p/v), no producen daño genotóxico detectado mediante la prueba de SMART.

Palabras Clave: Piper elongatum Vahl, aceite esencial, genotoxicidad, SMART y Mitomicina C.

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ABSTRACT

Genotoxic studies of the essential oil and ethanol extract of Piper elongatum Vahl was conducted by testing in vivo somatic mutation and recombination (SMART), which employs Drosophila melanogaster (fruit fly). Two types of crosses were used with genetic markers flr3 and mwh. The Standard cross (ST) and high bioactivation cross (HB), was employed, as a positive control mitomycin C (MMC) was used. The results were analyzed using statistical Kastenbaum-Bowman (α = 0.05) and they suggest that the ethanol extract of Piper elongatum Vahl at concentrations below 100mg/ml, and the essential oil at concentrations below 0.5% (w / v), do not produce genotoxic damage detected by the SMART test.

Key Words: Piper elongatum Vahl, essential oil, genotoxicity, SMART and MMC.

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INTRODUCCIÓN

Las especies vegetales han sido utilizadas desde principio de los tiempos  como fuente primaria para la elaboración de medicamentos. Las culturas asiáticas, hindúes y anglosajonas son líderes en el empleo de la medicina tradicional, proporcionando datos importantes de la utilización de estos recursos¹.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), hasta 1996 el 80% de la población mundial utilizaba las plantas medicinales en atención primaria. También es importante destacar que cerca de 7 mil fármacos provienen de conocimientos botánicos² y que actualmente las investigaciones farmacéuticas están enfocadas a buscar principios activos de diversas especies vegetales³.

Debido a las características ecológicas de Bolivia, se puede apreciar una amplia  variedad de especies  vegetales (3.000 especies  reconocidas hasta el 2006), que son empleadas como medicina tradicional por diversas culturas. En este sentido, la cultura Kallawaya ha contribuido al conocimiento del uso y manejo de plantas medicinales que se desarrollan en la región altiplánica⁴.

Los recursos genéticos representan oportunidades para impulsar el desarrollo económico, enmarcado dentro la sostenibilidad y equidad social. Estos recursos genéticos necesitan ser conservados junto al conocimiento tradicional, por ello se están incentivando diversas investigaciones⁵.

El Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquímicas (IIFB) está realizando continuas investigaciones para valorar la actividad biológica de varias especies vegetales. Por ejemplo, se ha demostrado los efectos antiparasitarios y genotóxicos de Galipea longiflora (Evanta)⁵ y Baccharis latifolia (Chillka). Respecto a la especie Piper elongatum Vahl se ha probado actividades antiinflamatorias, antifúngicas contra Neurospora crassa, cicatrizantes, efecto anti-Helicobacter pylori y efecto antiparasitario frente a Leishmania^6,7.

Piper elongatum Vahl crece en la región de Sud Yungas de Bolivia, es conocida comúnmente como “Matico”. La medicina tradicional la emplea como antiinflamatorio, hemostático, antiséptico⁸ y anti-infeccioso, descongestivo, contra la leucorrea y antiparasitario⁹. Esta especie posee en sus hojas un grupo de compuestos químicos llamados los crómenos, que han evidenciado efectos tóxicos en células y bacterias. Otros metabolitos secundarios presentes son los derivados del ácido benzoico prenilados que poseen actividad anti-bacteriana, citotóxica y las dihidrochalconas que poseen actividad contra los parásitos de Leishmania, además de una marcada relación de estructura-actividad contra el moho^{10, 11, 12, 13, 14}.

 Las características  benéficas demostradas  por Piper elongatum  Vahl sugieren la necesidad de profundizar  las investigaciones, por ello en este trabajo de investigación se emplea un ensayo biológico  in vivo denominado “Test  de Mutación y Recombinación  Somática” (SMART), que utiliza a Drosophila melanogaster como organismo experimental, para evaluar los niveles de genotoxicidad  de esta especie vegetal.

Teniendo  en cuenta la  situación  actual  de los estudios  genotóxicos de las plantas  medicinales, específicamente de Piper elongatum Vahl (Matico) y  conociendo las características antiinflamatoria, antifúngica, cicatrizante y  antiparasitaria de este género, además de  estar catalogada como  una especie ampliamente  utilizada por la  población boliviana, es necesario que se  realicen estudios  de toxicidad y genotoxicidad.

En el presente trabajo se evalúa la genotoxicidad del aceite esencial y del extracto etanólico de las hojas de Piper elongatum Vahl.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Recolección   y preparación del material vegetal. La especie vegetal P. elongatum fue recolectada del área de Sud Yungas del Cantón de Chicaloma (16º26’41.54”S; 67º28’47.85” W), población de Irupana ubicado en el departamento de La Paz. Se realizó la verificación de la especie vegetal con ayuda del Herbario Nacional de Bolivia LPB, Voucher 1p. Se pesó 500 g de la planta seca y pulverizada, se realizó una maceración con 2 litros de etanol destilado al 70% durante 48 horas a temperatura ambiente, posteriormente el macerado se filtró con ayuda de gasa y algodón, separando de esta manera la parte acuosa del residuo. Se procedió a concentrar el extracto acuoso, por rota vaporación (marca Laborata 4000 efficient – Heidolph HB digital) a 120rpm y 40°C.

Obtención del aceite esencial. Para la obtención del aceite esencial, se pesó 500g de hojas secas, las mismas fueron desmenuzadas y colocadas en el destilador realizándose así una extracción del aceite esencial mediante destilación por arrastre de vapor de agua.

Test de Mutación y Recombinación Somática en Drosophila melanogaster¹⁵. Para  la determinación de la  toxicidad del extracto etanólico y el aceite esencial, se emplearon 100 larvas de  tercer  instar de Drosophila melanogaster a diferentes  concentraciones, tanto para  el cruce Estándar (ST) como para el cruce  de alta  Bioactivación (HB), utilizando como control  negativo Tween al 3.5% (disolvente del extracto y aceite esencial). Como parámetro para determinar la toxicidad de un compuesto, se utilizó el porcentaje de sobrevivencia de los individuos tratados, considerando como dosis tóxica cuando el porcentaje de sobrevivencia fuese menor a 60% y una dosis sub-tóxica cuando el porcentaje de sobrevivencia fuese mayor a 60%  

Tratamiento  de individuos.  Para la evaluación de la genotoxicidad tanto del extracto (75, 50, 25 mg/ml) como del aceite esencial (0.5, 0.1, 0.05 y 0.01%), se procedió al recuento de las larvas de tercer instar procedentes de los cruce Estándar y Alta Bioactivación. En un número de 100 larvas por cada concentración de muestra empleada, fueron trasladados a sus respectivos frascos que contenían 1.5 g de Drosophila Instant Médium (Carolina Biological Supply, Burlington) y 5 mL de extracto por un lapso de 48 horas. Una vez desarrolladas las larvas que sobrevivieron hasta convertirse en moscas adultas, fueron recontadas y recolectadas en frascos con etanol al 70% para su mantenimiento. Este procedimiento se  realizó para cada una de las 2 etapas bajo las mismas condiciones de 25°C y 60% de humedad relativa.

Para el análisis de las alas tanto del cruce Estándar como el cruce de Alta Bioactivación se tomaron en cuenta los genotipos Trans-heterocigoto (mwh/flr³) y Heterocigoto (mwh/TM3), tanto de machos como de hembras que fueron fijadas con solución de Faure en portaobjetos, según el procedimiento de Graf  y  col. (2000). La lectura se realizó tomando en cuenta las diferentes áreas en que se subdivide el ala de la mosca descrita por Graf y col. (1984), donde se buscan marcadores genéticos fl³ o mwh^16,17.

 

RESULTADOS

Las hojas secas de la planta fueron sometidas a una extracción por arrastre de vapor para obtener el aceite esencial, con un rendimiento del 3.26% (15 ml); por otra parte se determinó que la densidad del aceite fue de 0.996 g/ml.

Las hojas secas de P. elongatum, fueron sometidas a una maceración con etanol durante 48 hrs. para luego ser procederse a la filtración y rotaevaporación, obteniéndose así el extracto total etanólico, con un porcentaje de rendimiento del 8%.

Tanto el aceite esencial y el extracto etanólico obtenido, se utilizaron para realizar los ensayos de toxicidad y genotoxicidad mediante la prueba de SMART.

Para la evaluación del potencial genotóxico del extracto etanólico de P. elongatum Vahl, se tomó en cuenta el número de moscas nacidas, que llegaron a su etapa adulta, las que posteriormente fueron recolectadas en etanol al 70% para proceder al montaje de alas para cada cruce (ST y HB) y genotipo (heterocigoto y trans- heterocigoto) de donde se obtuvo la frecuencia de pelos mutados presentes en cada ala.

En la Tabla 1 se observa que en el cruce Estándar la mayor frecuencia observada corresponde al control negativo, observándose una disminución proporcional en la frecuencia de manchas con relación a la concentración para los grupos con tratamiento, para MSP. Los valores obtenidos mediante el paquete estadístico, muestran resultados negativos para la actividad genotóxica del extracto a las 3 concentraciones evaluadas.

Tabla 1.	Análisis Estadístico del Potencial Genotóxico del extracto etanólico de P. elongatum mediante Cruce Estándar

Para las Manchas Simples Grandes, a la concentración de 25mg/ml se observó una frecuencia de 0.23 (MSG)/mosca, comparado con el control negativo que fue de 0.20 (MSG)/mosca, lo cual  no representa significancia estadística.

La frecuencia de Mancha Gemela (MG) encontradas en el control negativo es de 0.1 MG/mosca a una concentración de 25mg/ml; una frecuencia de 0.10 MG/mosca a 50 mg/ml y una frecuencia de 0.05 MG/mosca a la concentración de 75 mg/kg, estos datos nos reportan la ausencia de Manchas Gemelas.

En los datos  obtenidos  en el cruce HB, se analizó el genotipo trans-heterocigoto, reportados  en la Tabla  2; donde se  observó  una frecuencia  de 1.0 MSP/moscas para el control negativo, la cual es superior a las frecuencias obtenidas  en los tratamientos  con las diferentes concentraciones del extracto, mostrando  en éstos, un rango  que varía  de 0.10 a 0.80 MSP/mosca, reportándose el resultado como negativo para la actividad genotóxica del extracto etanólico, según el análisis estadístico aplicado.

Tabla 2.	Análisis Estadístico del Potencial Genotóxico del extracto etanólico de P. elongatum mediante Cruce Alta Bioactivación

Para el marcador MSG la frecuencia encontrada en el control negativo es de 0.30 MSG/mosca, la cual es mayor a las frecuencias obtenidas en los tratamientos con el extracto, que varía en un rango entre 0.10 a 0.13 MSG/mosca, datos que permiten determinar la actividad genotóxica del extracto como negativo, para este marcador a las concentraciones evaluadas.

No se observó ningún marcador de mancha gemela (MG) en los tres tratamientos con el extracto; en el control negativo la frecuencia fue de 0.15 MG/mosca. Estos datos permiten establecer que la actividad genotóxica del extracto es negativa.

Para el análisis del aceite esencial las larvas de tercer instar del cruce ST fueron sometidas a tratamiento crónico por 48 horas, a las concentraciones sub- tóxicas encontradas en la evaluación de toxicidad 0.01, 0.05, 0.1 y 0.5 %, analizándose el genotipo trans-heterocigoto. Los datos obtenidos permiten determinar una frecuencia de 0.40 manchas simples pequeñas MSP/mosca, a una concentración de 0.01% y 0.05% del aceite esencial de P. elongatum; a una concentración máxima de 0.5% la frecuencia encontrada fue de 0.75 MSP/mosca; en el control negativo la frecuencia de manchas encontradas fue de 1.00 MSP/mosca como se evidencia en la Tabla 3.

Tabla 3.	Análisis Estadístico del Potencial Genotóxico del Aceite esencial de P. elongatum mediante Cruce Estándar

En los datos obtenidos en el cruce HB se analizó el genotipo trans-heterocigoto, los mismos se reportan en la Tabla 4. Se observa que la frecuencia de manchas encontradas en los tratamientos con aceite esencial es menor a la frecuencia del control negativo, incluso se tiene ausencia de manchas gemelas que es un marcador relevante para la determinación de la genotoxicidad producida. De esta manera se confirma que el extracto, a las concentraciones evaluadas no induce genotoxicidad.

Tabla 4.	Análisis Estadístico del Potencial Genotóxico del aceite esencial de P.elongatum mediante Cruce Alta Bioactivación

 

DISCUSIÓN 

De las  larvas  que se sometieron al  tratamiento crónico con el extracto a concentraciones de 25, 50 y 75 mg/ml, durante 48 horas, se han obtenido los datos del porcentaje de  sobrevivencia  tanto para el cruce ST y el cruce HB, analizándose el genotipo trans-heterocigoto; en el cruce ST se evidenció una frecuencia de 1.18 de manchas simples pequeñas MSP/mosca a la  concentración de 25mg/ml y una frecuencia de  0.45 MSP/mosca a una concentración de 75mg/ml del extracto etanólico de P. elongatum.  En   el control negativo se observó una frecuencia de 1.53 MSP/mosca.

Los datos obtenidos en el análisis  estadístico del potencial  genotóxico mediante el cruce estándar, refieren que  el extracto etanólico a las concentraciones  evaluadas no induce daño  genotóxico, debido a que las  frecuencias de manchas encontradas son inferiores  respecto al control negativo,  lo cual indica  que  la genotoxicidad para el cruce ST el genotipo trans- heterocigoto, es  negativo  de acuerdo a los datos obtenidos mediante el paquete estadístico empleado.

Los resultados que se presentan en la Tabla 2, muestran que el extracto no es genotóxico ya que la frecuencia de manchas encontradas es menor a la frecuencia del control negativo. Incluso se tiene ausencia de manchas gemelas que es un marcador relevante para la determinación de la genotoxicidad producida. Se confirma, entonces, que el extracto a las concentraciones evaluadas no es genotóxico.

Realizando el análisis comparativo de la frecuencia total de manchas entre el cruce ST y HB, se puede observar que la frecuencia máxima es de 1.5 total de manchas (TM)/mosca a 25 mg/ml y la mínima frecuencia de 0.45 a una concentración de 75 mg/ml para el cruce ST; para el cruce HB la frecuencia máxima es de 0.93 TM/mosca a 50 mg/ml y la frecuencia mínima es de 0.45 a 75 mg/ml.

El análisis comparativo del total de  manchas  entre el cruce  ST y HB en relación al control negativo, demuestran que  el extracto etanólico de P. elongatum, no presenta efecto  genotóxico a las concentraciones evaluadas.

Por otra parte en la Tabla 3, se evidencia que la mayor frecuencia observada, en el cruce ST, respecto a MSP corresponde al control negativo, y los resultados demuestran una disminución en la frecuencia de manchas en relación a la concentración de cada tratamiento. La interpretación de estos valores mediante el paquete estadístico, demuestra un resultado negativo para la actividad genotóxica del aceite esencial, a las concentraciones evaluadas.

Respecto a las manchas simples grandes (MSG), la frecuencia encontrada fue de 0.05 MSG/mosca a una concentración de 0.01% y de 0.25 a una concentración 0.5%; las cuales están por debajo de la frecuencia del control 0.30 MSG/mosca, información que permite determinar que la genotoxicidad frente a este marcador es negativa.

En cuanto a la frecuencia de mancha gemela (MG), se ha determinado 0.15 MG/mosca para el control negativo. Comparando con los grupos de tratamiento, se ha observado que el rango de frecuencia de manchas está por debajo, entre 0.00 - 0.05 MG/mosca. Estos datos indican que el aceite esencial no presenta actividad genotóxica a ninguna de las concentraciones evaluadas, en comparación con el control negativo.

Los resultados obtenidos muestran que en ninguno de los marcadores analizados MSP, MSG y MG, el aceite esencial a concentraciones de 0.01, 0.05 y 0.1 % presenta genotoxicidad; sin embargo a la concentración de 0.5% los resultados obtenidos no permiten conclusiones definitivas debido a que el número de manchas encontradas son insuficientes para poder establecer si el aceite esencial presenta o no genotoxicidad a esa concentración.

Asimismo en el cruce HB se analizó el genotipo trans-heterocigoto, el cual se reporta en la Tabla 4. En el análisis de los datos de las MSP, se observó una frecuencia de 1.0 MSP/moscas para el control negativo, que es superior a las frecuencias obtenidas en los tratamientos con el aceite esencial de P. elongatum, que varía en un rango de 0.70 a 0.10 MSP/mosca. Comparando estos datos con el control negativo, aplicando el análisis estadístico, se pudo determinar que el aceite esencial no es genotóxico a las concentraciones evaluadas.

Para el marcador MSG, la frecuencia encontrada en el control negativo es de 0.30 MSG/mosca, mayor a la frecuencia de los tratamientos con el aceite esencial, en un rango que varía entre 0.05 a 0.07 MSG/mosca para la mínima y máxima concentración empleada respectivamente.

Por otra parte, respecto al marcador de manchas gemelas MG, no se ha observado presencia de las mismas a las concentraciones evaluadas, a excepción del control negativo que presentó una frecuencia de 0.15 MG/mosca, lo cual demuestra que los resultados son negativos. De esta forma se determinó que el aceite esencial no es genotóxico para este marcador a las concentraciones evaluadas, ya que los resultados evidencian que la frecuencia de manchas encontradas está significativamente por debajo de la frecuencia del control negativo. 

El análisis estadístico de todos estos datos indica que el aceite esencial no evidencia actividad genotóxica mediante el ensayo de SMART.

La observación de una baja frecuencia de MSP/mosca en el cruce ST a las concentraciones evaluadas, tanto para el extracto etanólico como para el aceite esencial, indican que sus componentes son de acción directa, pues cuando un compuesto actúa de manera directa normalmente se producen daños genéticos tardíos, debido a que los compuestos necesitan activarse para poseer actividad, dando como expresión fenotípica la formación de mayor número de manchas simples pequeñas, en relación a las manchas simples grandes, las cuales se  presentan cuando  el compuesto  actúa en las  etapas iniciales de división mitótica.¹⁸

Un comportamiento similar se observó en las moscas provenientes del cruce HB, dando un resultado de actividad genotóxica negativa para todas las concentraciones evaluadas, tanto para el marcador MSP como para MSG. Estos resultados sugieren que los compuestos presentes en el extracto y aceite esencial al pasar por la ruta metabólica  vía Citocromo P-450 se convierten en metabolitos menos activos, que aquellos que sufren metabolización, considerando que el Cruce HB posee un nivel elevado  del citocromo P-450 en comparación con el cruce ST, sugiriendo así que el extracto no posee capacidad pro- mutagénica, o  que sus componentes  no sufren  metabolización por la Vía Citocromo P – 450, mediante la prueba de mutación y recombinación  somática.¹⁷ Es importante esta observación pues existen compuestos que reportaron resultados negativos en el cruce ST, detectándose que su actividad es mutagénica sólo mediante el cruce HB, tal es el caso de nitro derivados, o compuestos como el safrol y eugenol, que son genotóxicos de acción directa¹⁹.

Los resultados obtenidos en la evaluación genotóxica del extracto  etanólico muestran que el mismo no es genotóxico, mediante el cruce ST en  D. melanogaster,  debido a que la frecuencia total de manchas encontradas  en las tres concentraciones evaluadas son inferiores a las del control negativo. Respecto al aceite esencial, los datos obtenidos muestran un comportamiento similar a los del extracto etanólico, debido a que a las concentraciones evaluadas dieron una frecuencia total de manchas para el cruce ST que son menores a las del control negativo.                

Si se comparan las frecuencias de manchas  totales encontradas  tanto en el extracto  etanólico como en el aceite esencial de P. elongatum Vahl, con las de la Mitomicina C, se observa que las frecuencias encontradas en el aceite esencial son  significativamente  inferiores a las frecuencias de Manchas  Totales   reportadas con Mitomicina C, a concentraciones de 0.05 mM (0.016mg/ml).

La frecuencia total de manchas en las moscas trans-heterocigotas no posee un incremento estadísticamente significativo, interpretando este resultado como negativo para el cruce ST, lo que significa que ni el extracto etanólico ni el aceite esencial, son capaces de producir mutaciones puntuales, disyunción, deleción o recombinación, sugiriendo así que ninguna de las muestras poseen actividad mutagénica directa mediante el Test de Mutación y Recombinación Somática.

En el presente estudio, el aceite esencial y el extracto etanólico de P. elongatum, tanto para los mutágenos directos como los indirectos en las concentraciones evaluadas, dan una respuesta negativa, razón por la cual se descarta a la especie vegetal P. elongatum Vahl como agente recombinogénico, mediante la prueba de SMART, debido a que el total de manchas no presenta un incremento estadísticamente significativo dando como expresión fenotípica  la formación de MSP  en  un número mayor a las MSG y la ausencia de MG nulas. En la mayoría de los casos, estas últimas son producidas exclusivamente por la recombinación mitótica, lo que indica que, ni el aceite esencial ni el extracto etanólico, inducen a una recombinación mitótica en forma directa sobre el DNA, ni de manera indirecta. En cuanto a las manchas simples pueden ser producidas por varios mecanismos.²⁰

El análisis de los datos obtenidos en este estudio sugieren que el extracto etanólico y el aceite esencial, no poseen la capacidad de promover el desarrollo de procesos cancerígenos, debido a que el proceso de recombinación mitótica inhibe la acción de los genes supresores de tumores siendo en muchos casos un factor desencadenante de cáncer.

El extracto  total etanólico de P. elongatum no ejerce una actividad genotóxica directa y tampoco una actividad genotóxica indirecta detectada por el test de mutación y recombinación somática SMART de D. melanogaster. El aceite esencial de P. elongatum   no demuestra actividad genotóxica directa y tampoco actividad genotóxica indirecta detectada por el test de mutación y recombinación somática ( SMART) de D. melanogaster.

 

AGRADECIMIENTOS 

Al proyecto de  acción de integrada “Plantas  medicinales en Bolivia  como recurso  terapéutico”, PCI  D/020523/08; al proyecto IDH, “Evaluación de la Toxicidad de Plantas medicinales”; a la comunidad  de Chicaloma de Irupana - Yungas por permitir  la colecta de la especie vegetal.

 

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