ARTÍCULO ORIGINAL

 

Actividad tripanocida y antioxidante in vitro de los extractos etanólicos de Caesalpinia pluviosa DC. y Astronium urundeuva (Allemâo) Engl.

 

Trypanocidal and antioxidant in vitro activities of ethanolic extracts from Caesalpinia pluviosa DC. and Astronium urundeuva (Allemâo) Engl.

 

 

Victoria  Muñoz Ortiz ¹, Patricia Mollinedo², Patricia Garcia² 

¹ Universidad Mayor de San Andrés, Facultad de Medicina, Departamento de Patología. Av. Saavedra No 2246, La Paz, Bolivia.
²Universidad Mayor de San Andrés, Facultad de Ciencias Puras, Carrera de  Química. La Paz, Bolivia.

Dirección para correspondencia: Victoria Muñoz Ortiz. Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad Mayor de San Andrés. Av. Saavedra No 2246, La Paz, Bolivia.
E mail: victoriamuo@hotmail.com

Recibido para publicación en: 16/12/10
Aceptado en 30/09/11

 

 

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RESUMEN 

Caesalpinia pluviosa DC y Astronium urundeuva (Allemâo) Engl. , son plantas medicinales de uso tradicional en Bolivia. Para determinar la actividad tripanocida y antioxidante in vitro de los extractos etanólicos de estas especies vegetales, se realizó la medición de la inhibición del desarrollo in vitro de tripomastigotes de Trypanosoma cruzi, clon CL Brener. Los métodos antioxidantes fueron 1,1-difenil-2-picril-hidrazil  (DPPH) y 2,2-azino-bis (3- etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico ácido) diamonio sal (ABTS). El extracto etanólico de la corteza de Caesalpinia pluviosa DC tuvo la mayor actividad tripanocida (CI₅₀ = 55 µg/ml +7,07) y antioxidante (CI₅₀ = 0,166mg/ml por el método ABTS y CI₅₀ = 1,30 por el método DPPH). En conclusión, este estudio revela que los extractos de Caesalpinia pluviosa DC y Astronium urundeuva (Allemâo) Engl., tienen un efecto tripanocida y antioxidante in vitro, justificando el uso tradicional de la planta y constituyéndose en excelentes candidatos para completar estudios biológicos in vivo y químicos. Esta asociación de actividad antioxidante-tripanocida, es una nueva perspectiva para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

Palabras Clave: Actividad tripanocida; Antioxidante; in vitro; plantas medicinales; Bolivia.

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ABSTRACT 

Caesalpinea pluviosa DC and Astronium urundeuva (Allemâo) Engl., are used in Bolivia, as medicinal plants. In order to determine the in vitro trypanocidal and antioxidant activity of ethanolic extract from Caesalpinia pluviosa DC (Steam Bark) and Astronium urundeuva.(Allemâo) Engl. The inhibitory effect on the growth of tripomastigotes (Trypanosoma cuzi, clone CL Brener), was evaluated. The antioxidant capacity was evaluated by 1,1-diphenyl-2-pycril-hydrazil (DPPH) and  2, 2-azino-bis(3-_ethylbenzo-tiazolin-6-sulfonic acid) diamonium salt (ABTS) methods. Ethanolic extract of Caesalpinia pluviosa DC showed the greatest trypanocidal activity (CI₅₀ = 55 µg/ml +7.07) and antioxidant capacity (CI₅₀ = 0,166 mg/ml by the ABTS method and₅₀ IU = 1.30 by the DPPH method). According to our results the polar extracts of Caesalpinia pluviosa DC and Astronium urundeuva (Allemâo) Engl., are excellent candidates to complete in vivo biological and chemical studies. In addition, the combination of antioxidant-trypanocidal activities is a new perspective for the treatment of Chagas disease.

Key Words: Trypanocidal activity; Antioxidant; In vitro, Medicinal plants; Bolivia 

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INTRODUCCIÓN

Pese a los adelantos tecnológicos de los últimos años, la enfermedad de Chagas esta presente en el continente americano, desde hace mucho más de 100 años¹.

Doce millones de personas están afectadas en el mundo. Bolivia, presenta la tasa más alta de infección de América Latina en esta zoonosis, el 50% del territorio es endémico, el 20% de la población estaría infectada, el 48% de los donadores de sangre presentan una serología positiva².  Prácticamente, en países como Uruguay, Chile y Brasil se interrumpió la propagación vector-humano³. En Bolivia persiste la presencia vectorial incluso en zonas populares urbanas⁴.

Las limitaciones en el tratamiento son evidentes, las drogas sintéticas como el Nifurtimox y el Benzanidazol, tienen mayor efectividad en la fase aguda de la enfermedad y lamentablemente su eficacia es limitada en la fase crónica, así mismo presenta importantes efectos no deseados⁵.

Por otra parte, los radicales libres y especies reactivas de oxigeno (EROs) son ampliamente conocidos por inducir patogénesis celular y de tejido, dando lugar a una variedad de enfermedades humanas como el cáncer, procesos inflamatorios, enfermedades cardiovasculares, neurodegenerativas y procesos de envejecimiento⁶.

Las sustancias antioxidantes pueden bloquear la acción nociva de los radicales libres, destoxificando el organismo. La búsqueda de antioxidantes a partir de extractos de plantas se ha intensificado en los últimos años.

Se ha determinado que la actividad antioxidante de las plantas se debe principalmente a compuestos fenólicos como los flavonoides, ácidos fenólicos, taninos y diterpenos fenólicos⁷.

Caesalpinia pluviosa DC., árbol tropical y subtropical, de aproximadamente 8 m de alto, pertenece a la familia Leguminosae, conocido en el oriente boliviano con el nombre común de “Momoqui”, la corteza, se utiliza principalmente en los procesos diarreicos y en dolores de la parta baja de la espalda, de los riñones y como diurético⁸.

Varios estudios confirman que diferentes extractos de hojas, frutos, raíces y corteza de especies vegetales pertenecientes al género Caesalpinia tienen una variedad de propiedades medicinales como la antiinflamatoria, antitumoral, antipirética, analgésica, inmunomoduladora, filaricida, antibacteriana, antimicótica, antiparasitaria y antiviral^{9,10,11,12,13,14,15,16}.

La actividad antioxidante fue la más reportada en diferentes especies del género Caesalpinia tales como C. pyramidalis C. bonducella, C. digyna, C. crista, C. benthamiana, C. sappan y C. pulcherrima^17,18,19,20. Las actividades biológica reportadas para la especie Caesalpinia  pluviosa  son  la  antimalárica  y  citotóxica^21,22.

Astronium urundeuva (Allemâo) Engl. (Anacardiaceae), árbol de 5 m de alto, se encuentra en los departamentos de Beni, Santa Cruz y Tarija, conocido con el nombre común de “Cuchi”, su corteza se utiliza principalmente, para las fracturas, traumatismos, cortaduras heridas, procesos inflamatorios, acelera la cicatrización, para tratar úlceras en el estómago en los procesos hemorrágicos en las mujeres con menstruaciones abundantes⁸. También se reporta la actividad antioxidante, inmunomoduladora, citotóxica y para el tratamiento las úlceras. ^22,23,24,25.

El uso de la medicina tradicional ampliamente distribuido, en particular, la utilización de las plantas medicinales, constituye  una fuente de tripanocidas y antioxidantes naturales que deberían servir como cabeza de serie para el desarrollo de nuevas drogas. Después de una búsqueda bibliográfica importante en diferentes bases de datos constatamos que existe ausencia de estudios de actividad tripanocida para ambas especies estudiadas.

El propósito de este estudio es el de determinar la actividad dual, tripanocida y antioxidante de Caesalpinia pluviosa  y Astronium urundeuva.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Plantas. Las hojas y corteza de Caesalpinia pluviosa y Astronium urundeuva se recolectaron en la Provincia Ballivian, departamento del Beni, en la comunidad de San Josecito. Las muestras de herbario para su identificación por especialistas, fueron depositadas en el Herbario Nacional de Bolivia en La Paz. Los números de vouchers fueron VM6 y VM9 respectivamente.

Preparación de los extractos. La hojas y corteza de la planta fueron secadas y molidas y maceradas con etanol-agua (70-30%) por 48 horas a 25 °C, evitando la radiación de la luz del día. La solución acuosa etanólica obtenida, fue evaporada al vacío y el residuo fue evaluado ²¹. 

Ratones y parásitos.  Se utilizaron los ratones Swiss de 6-8 semanas de vida, infectados con el clon CL Brener de Trypanosoma cruzi²⁶. La cepa del parásito, fue obtenida del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud. Departamento de Medicina Tropical, Asunción Paraguay, se la mantuvo en los ratones por inoculación intraperitoneal cada 14 días.

Ensayo biológico, contra las formas tripomastigotes. Los extractos de plantas a evaluar se disolvieron en dimetilsulfoxido (DMSO) y se prepararon diferentes concentraciones (500, 250, 100, 50 y 10 µg/ml) con el medio de cultivo LIT (Liver Infusion Triptosa), estas concentraciones fueron mezcladas con igual volumen de sangre parasitada. La densidad del parásito calculada fue de 2x10⁵/0.1ml para cada alveolo, se incluyeron alvéolos controles positivos para el DMSO y controles negativos con violeta de genciana. Después de incubar a 4°C por 24 horas, se cuantificó la suspensión microscópicamente, utilizando una cámara de Neubauer. 5 µl de sangre diluida 1:5 en solución tampón de lisis (0,75% NH₄Cl, 0,2% Tris pH 7.2)²⁷. Se determinó la CI₅₀ (concentración inhibitoria del 50% del desarrollo de los tripomastigotes) por el método gráfico²⁸. 

Pruebas antioxidantes in vitro.  Método 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH). 2,7 mg de extracto etanólico crudo de las plantas fueron disueltos en 30µL de DMSO (GFS CHEMICLAS®) diluidos en 970µl de H₂O destilada convirtiéndose en la solución madre (C1).

Los extractos se prepararon a seis concentraciones (2,7; 0,27; 0,135; 0,07; 0,04 y 0,027mg/ml) con metanol p.a. La solución DPPH (Sigma Chemicals D-9132) fue preparada a la concentración de 0.004% (Peso/volumen) también en metanol p.a. (0,0038g DPPH para 95ml de metanol).

La medición de la actividad antioxidante se realizó adicionando 1ml de solución DPPH a 0,01ml de las soluciones de los extractos a evaluar.

Después de 30 min. de la reacción, se determinó la absorbancia a 517nm. en el espectrofotómetro ultra violeta visible (Type Helios Alpha Nº UVA 080334). Se usó como blanco metanol p.a. como control positivo quercetina (Sigma Q-0125, 25g Lot. 90 K) y como control negativo DPPH puro.

Las pruebas para cada extracto a evaluar se realizaron por triplicado. Se obtuvieron los valores de CI₅₀ (Concentración inhibitoria del 50%) a través de gráficas tomando en cuenta el porcentaje de inhibición y la concentración²⁹. 

Método 2,2-azino-bis(3- etilbenzo-tiazolina-6-sulfonico acido) diamonio sal (ABTS). El radical ABTS•+ se formó tras la reacción de ABTS (7mM) con persulfato potásico (2,45mM, concentración final) incubados a temperatura ambiente y en oscuridad durante 16 hs. Este radical se diluyó con etanol hasta obtener un valor de absorbancia de 0,700 ± 0,100 a 754nm (longitud de máxima absorción). Las muestras filtradas se diluyeron con etanol hasta que  se obtuvo un 20-80% de inhibición comparadas con la absorbancia del blanco tras añadir 20μL de la muestra.

A 980μl de dilución del radical ABTS•+ así generado se determina la absorvancia a 754nm a 30ºC, se añade 20μL de la muestra y se mide nuevamente la absorvancia pasado 1 minuto. La absorbancia fue medida después de 4 minutos. El antioxidante sintético Trolox de referencia a concentración de 0-15μM (concentración final) en etanol se ensayó en las mismas condiciones y los resultados son expresados en TEAC (actividad antioxidante equivalente a Trolox) ³⁰.  

 

RESULTADOS

Las concentraciones inhibitorias del 50% del desarrollo de los tripomastigotes de T. cruzi, de los extractos etanólicos  de las 2 plantas medicinales estudiadas, se expresan en la Tabla 1. El extracto etanólico de la corteza de Caesalpinia pluviosa tuvo la mayor actividad tripanocida (CI₅₀ = 55 µg/ml + 7,07) y antioxidante (CI₅₀ = 0,166 mg/ml por el método ABTS y CI₅₀ = 1,30 mg/ml) por el método DPPH, seguido del extracto de hojas, ambos resultados no son comparables al violeta de genciana, quimioprofilactico sanguíneo, control positivo y a la quercetina.

 

DISCUSIÓN 

Se detectó una actividad tripanocida, sobre los tripomastigotes de T. cruzi de la corteza (CI₅₀ = 55+7,07 µg/ml), las hojas de C. pluviosa (CI₅₀= 125+35,35 µg/ml) y la corteza de A. urundeuva (175+35,5 µg/ml). La actividad tripanocida-antioxidante de ambas especies es reportada por primera vez en este estudio.

Observamos que hay una diferencia entre las CI₅₀ de las hojas y la corteza de C. pluviosa, que es atribuida a la composición química diferente en los distintos órganos de la planta.

La actividad antioxidante está relacionada a flavonoides y compuestos fenólicos en general, sin embargo, la estructura y la capacidad de resonancia en el núcleo fenólico son mucho más importantes para la actividad antioxidante, que el número de hidroxilos sustituyentes del anillo aromático.  Este tipo de estructuras son las que se pueden apreciar en los metabolitos secundarios presentes en  especies de los géneros Caesalpinea y Astronium como los fenolicos protosappanin A, protosappanin B, brazilein, bergenin, los diterpenoides cassane, betamina 1 y 2^31,32. En el caso especifico de la corteza de tronco de C. pluviosa la presencia de bisflavonoides se muestran en su actividad elevada de antioxidante por ABTS, no similar, pero, comparable al método DPPH, la diferencia de estos resultados se puede deber a la cinética de la reacción y el tamaño de las estructuras tanto del radical de mayor tamaño ABTS y los bisflavonoides comparados con la estructura del DPPH y de cinética más lenta.  Por otro lado ambos extractos C. pluviosa y A. urundeuva, tienen un IC₅₀ cercano al valor de la Quercetina, tratándose de fitocomplejos y no de una molécula pura,  estos muestran una muy buena actividad antioxidante.

La enfermedad de Chagas está caracterizada por una inflamación crónica. El desequilibrio entre las defensas prooxidantes y antioxidantes es conocido como stress oxidativo y está asociado con frecuencia con procesos inflamatorios. Este estress oxidativo incrementa en forma paralela a la progresión de la enfermedad de Chagas³³. Habría, una correlación entre la carga parasitaria y la intensidad de los procesos inflamatorios y severidad de la enfermedad ³⁴.

Las estructuras antioxidantes de los extractos de las plantas podrían impedir el progresivo  stress oxidativo asociado con la enfermedad y atenuar las consecuencias del proceso oxidativo relacionadas a la tripanosomiasis.³⁵ Los resultados nos estarían sugiriendo que la actividad antioxidante podría jugar un rol importante en la actividad antiinflamatoria de la enfermedad de Chagas. A su vez podrían estar presentes metabolitos con actividad tripanocida, que podrían actuar en forma sinérgica.

En conclusión, este estudio revela que los extractos de Caesalpinia pluviosa y Astronium urundeuva tienen un efecto tripanocida y antioxidante in vitro, justificando el uso tradicional de la planta, constituyéndose en excelentes candidatos para completar estudios biológicos in vivo y químicos. Esta asociación de actividad antioxidante-tripanocida, es una nueva perspectiva para el tratamiento de la enfermedad de Chagas.

 

AGRADECIMIENTOS  

Este trabajo fue financiado por la UMSA (Universidad Mayor de San Andrés) /DIPGIS/IDH-2008

 

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