ARTÍCULO ORIGINAL

Actividad anti-Helicobacter pylori de Plantago major, Clinopodium bolivianum, Caléndula officinalis y Piper angustifolium por el método de difusión de disco

CLAROS P. Maysa^1,2; BILBAO R. Pablo¹; DAMIANI M. Esther¹; GONZALES D. Eduardo²; ESTENSORO C. Miguel²; ALVAREZ A. María T.²

¹ Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia, Instituto Nacional de Laboratorios en Salud, Laboratorio Nacional de Referencia en Bacteriología Clínica, C. Rafael Zubieta Nº1889 La Paz Bolivia, e-mail maysa_cp15@yahoo.es
² Universidad Mayor de San Andrés, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Av. Saavedra Nº2224, La Paz, Bolívia

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RESUMEN

Helicobacter pylori es una bacteria asociada a patologías gástricas como gastritis, ulceras, cáncer y linfoma de MALT. De acuerdo a estudios realizados en la ciudad de La Paz - Bolivia, aproximadamente el 50% de la población esta infectada por esta bacteria.

Al ser Bolivia un país que posee una extensa flora medicinal, en el presente trabajo se seleccionaron plantas con actividad antiulcerosa y antibacteriana reportadas: Plantago major (Llantén), Clinopodium bolivianum (Khoa), Caléndula officinalis (Caléndula) y Piper angustifolium (Matico), con el propósito de evaluar la actividad anti-Helicobacter pylori de extractos orgánicos y acuosos de estas plantas.

Se utilizaron extractos diclorometánico, hidroalcohólico y acuoso de las plantas en estudio para determinar su actividad inhibitoria por el método de difusión de discos en cultivo bacteriológico de cuatro cepas de Helicobacter pylori aisladas de biopsias de pacientes con patologías gástricas. La actividad de los extractos fue determinada según el diámetro del halo de inhibición.

Se determinó que los extractos diclorometánico, hidroalcohólico y acuoso de Clinopodium bolivianum, Caléndula officinalis y Piper angustifolium, tienen actividad anti-Helicobacter pylori. De igual manera, el extracto hidroalcohólico de Plantago major.

Palabras clave: Actividad Anti-Helicobacter pylori; Plantago major, Clinopodium bolivianum, Calendula officialis, Piper angustifolium.

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ABSTRACT

Helicobacter pylori is a bacteria associated with gastric pathologies such gastritis, ulcers, cancer and MALT lymphoma. According to previous studies in La Paz - Bolivia, approximately 50 % of the population is infected with this bacterium.

Bolivia is considered one of the most important countries due to its extensive medicinal plants. The present study evaluates the antibacterial activity of organic and aqueous extracts of Plantago major (Llantén), Clinopodium bolivianum (Khoa), Calendula officinalis (Calendula) and Piper angustifolium (Matico) against Helicobacter pylori.

Dichloromethane-, Hydroalcoholic- and aqueous- extracts were tested using the Disk diffusion method with 4 wild-type strains of Helicobacter pylori isolated from biopsies of patients with gastric pathologies. The activity of the extracts was determined according to the diameter of the halo of inhibition.

Dichloromethane, Hydroalcoholic and aqueous extracts of Clinopodium bolivianum, Calendula officinalis and Piper angustifolium were found active anti-Helicobacter pylori. Similarly, the hydroalcoholic extract of Plantago major.

Key words: Activity anti-Helicobacter pylori; Plantago major, Clinopodium bolivianum, Calendula officialis, Piper angustifolium.

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INTRODUCCION

Helicobacter pylori es una bacteria gram negativa de morfología curvada y espiral, es el agente etiológico que se asocia a patologías gástricas como la gastritis, ulceras, cáncer y linfoma de MALT ^1,2,3,4. Se conoce que el modo de transmisión de esta bacteria puede ocurrir de persona a persona, por vía oral-oral y/o fecal-oral. Estudios realizados en la ciudad de La Paz, Bolivia, demuestran que aproximadamente el 50% de la población presenta infección por Helicobacter pylori.^1,5

Existen muchas publicaciones en el mundo de estudios sobre la actividad anti-Helicobacter pylori de plantas medicinales tanto in vitro como in vivo ^4,6,7,8,9,10 en busca de una terapia alternativa natural, debido a que las terapias con fármacos sintéticos tienen una eficacia del 92%.¹¹

Bolivia es un país que posee una extensa flora medicinal utilizada por diversas etnias y culturas, para tratar distintas enfermedades. En el presente trabajo se seleccionaron plantas que poseen actividad antiulcerosa y diferentes espectros de acción antibacteriana, reportadas en diferentes artículos científicos ^{12,13,14,15,16,17}, y libros de medicina tradicional ^18,19,20.

El objetivo de este trabajo fue la determinación de la actividad anti-Helicobacter pylori, por el método de difusión de disco de los extractos diclorometánico, hidroalcohólico y acuoso de las plantas seleccionadas: Plantago major (Llantén), Clinopodium bolivianum (Khoa), Caléndula officinalis (Caléndula) y Piper angustifolium (Matico).

 

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal y extracción

Las plantas fueron recolectadas en octubre de 2005, en la ciudad de La Paz.

Dicho material fue lavado con agua destilada estéril y desecado en estufa a 38ºC por el lapso de dos días. Una muestra seca de cada especie vegetal fue autentificada y clasificada por el Herbario Nacional de Bolivia. En todos los casos, las hojas fueron separadas y pulverizadas.

La extracción de compuestos de baja polaridad se realizó por maceración en frío al 20% p/v del material vegetal en diclorometano. La extracción hidroalcoholica (etanol 75%) se realizó a partir del residuo seco resultado de la extracción diclorometánica, adicionando 50 ml de hidroalcohol²¹. Ambos extractos fueron secados por rotaevaporación. El extracto acuoso se realizó por infusión al 10% p/v del material vegetal en agua destilada estéril con la posterior liofilización del mism

Cepas bacterianas

Se estudiaron cuatro cepas de Helicobacter pylori denominadas HAIA112, CCPA9, CCPC38 y CCPA62, cedidas en medio de transporte Wang por el Laboratorio Nacional de Referencia en Bacteriología Clínica del Instituto nacional de laboratorios en salud (INLASA). Dichas cepas fueron sembradas en Agar Base Columbia (Oxoid, Inglaterra) con sangre desfibrinada de carnero al 7% suplementado con Isovitalex al 1% (Britania, Argentina). Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 3 días en atmósfera microaerofilica en jarra de anaerobiosis Gas Pack de 2.5 L, atmósfera de 85% N₂, 10% CO₂ y 5% O₂ (generadores CampyGen CN 25). Se realizó la identificación macroscópica, microscópica y bioquímica. Estas cepas fueron identificadas en comparación con la cepa Helicobacter pylori ATCC 49503.

Determinación de la actividad anti-Helicobacter pylori por difusión de disco

A partir de un cultivo en abundancia de 2 días de incubación, se realizó la suspensión bacteriana en 2 mL de solución fisiológica estéril (NaCl 0.9%) hasta alcanzar el patrón de turbidez del tubo 4 de la escala McFarland. Esta suspensión fue sembrada por inundación en placas de Agar Base Columbia con sangre desfibrinada de carnero al 7% suplementado con Isovitalex al 1%. Posteriormente se aplicaron los discos de papel filtro Wattman Nº5 de 6 mm de diámetro previamente empapado con: 1) antibiótico (control positivo): solución de 10 _l de tetraciclina 3 _g/_l, 2) solventes de extracción (control negativo), 10_l de los disolventes utilizados en la extracción de las especies vegetales (diclorometano, etanol al 75% y agua destilada estéril), 3) extracto vegetal: solución de 10 _l de los extractos a concentración de 0,6 _g/_L (los extractos fueron disueltos en el mismo solvente de extracción). Las placas fueron incubadas en jarra de anaerobiosis y con generadores de atmósfera microaerofilica (anteriormente citada) en estufa de 37ºC durante tres días, siguiendo la norma CLSI. Transcurrido este tiempo los halos de inhibición fueron medidos con la ayuda de un calibrador.

 

RESULTADOS

La Tabla No. 1 muestra el promedio de los resultados de la actividad Anti-Helicobacter pylori expresado en diámetro de halo de inhibición (mm) de discos impregnados con tetraciclina, además muestra la actividad de la tetraciclina según la clasificación de Boyanova et al 1999 (22). El análisis estadístico se realizó por ANOVA denominándose como estadísticamente significativo para un nivel de confianza del 95%(*) y 99%(**). La columna de control negativo es el promedio del resultado obtenido del antibiograma del solvente de la tetraciclina.

 

La Tabla No. 2 muestra el promedio de los resultados de la actividad Anti-Helicobacter pylori expresado en diámetro de halo de inhibición (mm) de discos impregnados con los diferentes extractos vegetales de las especies estudiadas. Además muestra la actividad de cada extracto según la clasificación realizada por Wang. El análisis estadístico se realizó por ANOVA denominándose como estadísticamente significativo para un nivel de confianza del 95%(*) y 99%(**). La columna de control negativo es el promedio del resultado obtenido del antibiograma de los tres solventes (diclorometano, hidroalcohólico, acuoso).

 

DISCUSIONES

El uso de la quimioterapia para erradicar a Helicobacter pylori es bastante compleja, fastidiosa, y costosa. Bolivia tiene elevados índices de pobreza, por lo que resulta oneroso para algunas familias acceder al tratamiento.

Rescatando los conocimientos de nuestras etnias y culturas, las mismas que sugieren terapias alternativas en base al uso de plantas medicinales, en este trabajo determinamos la actividad anti-Helicobacter pylori de las especies Plántago major, Clinopodium bolivianum, Calendula officinalis, y Piper angustifolium.

Se seleccionó a la Tetraciclina como control negativo debido a que este antimicrobiano es utilizado en la terapia alternativa para la erradicación de Helicobacter pylori cuando fracasa la terapia de primera elección (claritromicina, amoxicilina, omeprazol). Además estudios realizados muestran que la resistencia a este antibiótico de amplio espectro es del 19% siendo el menor entre todos los antibióticos utilizados contra el Helicobacter pylori. En todas las cepas, la tetraciclina ejerció una elevada actividad anti-Helicobacter pylori que según la clasificación de Boyanova para un disco de 30_g de antibiótico, Helicobacter es sensible cuando el halo de inhibición es mayor a 30 mm y el promedio general de halo de inhibición obtenido en este estudio fue de 50,8 mm.

La actividad inhibitoria sobre las cepas de Helicobacter pylori del extracto hidroalcohólico de Plantago major podría deberse a un aglicon de la aucubina denominado aucubigenina liberado por una _-glucosidasa. Este compuesto químico según Tedrogen tiene actividad antibacteriana.

Un estudio realizado por Figueroa señala que los aceites escenciales de Clinopodium bolivianum (antes Satureja boliviana) poseen actividad antibacteriana in vitro sobre Staphylococcus aureus (coco gram positivo), Bacillus subtilis, Shigella flexneri, Escherichia coli y Salmonella enteritidis (bacilos gram negativo). En este estudio se observó que el extracto diclorometánico que contiene los aceites de esta especie tiene elevada actividad contra Helicobacter pylori que es un bacilo gram negativo por lo tanto se recomienda que para estudios posteriores se aíslen estos aceites escenciales y se pruebe nuevamente sobre esta bacteria. Como existe poca información sobre los fitoconstituyentes de esta especie queda la incógnita de saber cuales son los componentes que le dan la actividad anti-Helicobacter pylori en los otros extractos hidroalcohólico y acuoso.

La evaluación de la actividad antibacteriana in vitro sobre Staphylococcus aureus y Streptococcus fecalis de Caléndula officinalis realizada por Vanaclocha reportó que esta especie posee dicha actividad sobre estos cocos gram positivos, no haciendo referencia a los compuestos responsables de este efecto. En el presente estudio se evaluó la actividad antibacteriana de la Calendula sobre una bacteria gram negativa como es el Helicobacter pylori y como se puede observar en los resultados los tres extractos fueron activos. Correspondería indagar si esta especie vegetal puede responder como antibacteriano sobre otras bacterias gram negativas ya sean cocos o bacilos, esto para determinar el espectro antibacteriano.

La evaluación de la actividad bacteriostática in vitro de los aceites escenciales de Piper angustifolium sobre Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli realizada por Tirillini mostró que esta especie posee dicha actividad sobre estos bacilos gram negativos. En el presente estudio como se ve en la tabla 2, el extracto diclorometánico (donde se extraen los aceites escenciales) mostró actividad sobre cepas de Helicobacter pylori, por tanto observando la coincidencia de los espectros de acción, se puede inferir que estos aceites actúan sobre bacilos gram negativos, aunque habría que realizar pruebas sobre otras bacterias.

En conclusión se ha evidenciado que los extractos diclorometánico, hidroalcohólico y acuoso de Clinopodium bolivianum, Caléndula officinalis y Piper angustifolium, tienen actividad anti-Helicobacter pylori; de igual manera el extracto hidroalcohólico de Plantago major.

 

RECOMENDACIONES

Realizar estudios in vitro sobre Helicobacter pylori de los siguientes compuestos: aucubigenina de Plantago major, aceites escenciales de Clinopodium bolivianum, kaempferol de Piper angustifolium, ya que de acuerdo a otros estudios estos compuestos serian los responsables de la actividad antibacteriana de estas plantas, sin embargo queda probar su actividad anti-Helicobacter pylori.

Realizar estudios de toxicidad y pre-clínicos de las especies vegetales mencionadas para probar el efecto anti-Helicobacter pylori in vivo.

 

AGRADECIMIENTOS

Proyecto “DEVELOPMENT OF NOVEL VACCINATION STRATEGIES AGAINST HELICOBACTER PYLORI IN LATIN AMERICA”, global health research initiative (ghri) operational research grants for the canadian international immunization initiative (ciii2)/ OPS-OMS., 2004-2006, Dr. Alvaro Cárdenas y Dr. Carlos Ascarrumz (Gastroenterólogos).

 

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