ARTÍCULO ORIGINAL

Aislamiento y cultivo de bacterias sulfato reductoras acidófilas para la Producción de Sulfuro Biogénico para la precipitación de metales pesados

GUTIERREZ R. Alvaro Victor; TERRAZAS S. Luis Enrique; ÁLVAREZ A. Maria Teresa

Area de Biotecnología - Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas, Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, Avda Saavedra 2224, Universidad Mayor de San Andrés, La Paz - Bolivia. Email: alvarogutierrezrojas@gmail.com

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RESUMEN

Los drenajes ácidos de mina (DAM) están caracterizados por acidez extrema y altas concentraciones de metales pesados y sulfatos. Las bacterias sulfato reductoras (BSR) reducen sulfatos oxidando la materia orgánica para la producción de sulfuro de hidrogeno y bicarbonato. La biorremediación consiste en la precipitación insoluble del sulfuro con los metales pesados y la alcalinización del medio por el bicarbonato.

Se estudiaron muestras de lodo en condiciones acidas provenientes de la región altiplánica a través del establecimiento de columnas de Winogradsky. La zona sulfato reductora fue inoculada en condiciones anaerobias y pH 4 con distintas fuentes de carbono, entre ellas residuos agrícolas. Se establecieron 2 consorcios sulfato reductores acidófilos, capaces de ser aplicados a biorreactores para la producción de sulfuro de hidrogeno en condiciones acidas. El establecimiento de sistemas de biorremediación en dichas condiciones permitirá el tratamiento directo de drenajes ácidos de mina utilizando residuos agrícolas como materia orgánica oxidable.

Palabras clave: drenajes ácidos de mina, bacterias sulfato reductoras, biorremediación, acidófilas.

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ABSTRACT

The acid mine drainage (AMD) are characterized for extreme acid and high concentration of heavy metals and sulfate. Sulfate reducing bacteria (SRB) reduce sulfate oxidizing organic matter for production of hydrogen sulfide and bicarbonate. Bioremediation consist in insoluble heavy metal precipitation with sulfide and alkalinizing the environment due to the formation of bicarbonate.

Several sludge samples taken from Bolivian Andean region were studied in acid conditions through the establishment of the Winogradsky column. Sulfate-reducing zone was inoculated in anaerobic conditions and pH 4 with different carbon sources, agricultural wastes among them. Two acidophilic sulphate-reducing consortia were established to be applied in bioreactors for hydrogen sulfide production in acid conditions. The establishment of bioremediation system in these conditions allows the direct treatment of acid mine drainage using agricultural wastes as oxidized matter.

Key words: acid mine drainage, sulfide reducing bacteria, bioremediation, acidophilic.

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INTRODUCCION

Durante las actividades mineras y metalurgicas, la generacion de Drenajes Acidos de Mina es extensa en algunos paises del mundo. Los DAM se caracterizan por un pH bajo, grandes concentraciones de metales pesados y sulfatos; afectando el medioambiente severamente¹. La contaminación por DAM es un problema de gran magnitud. La acidificación y altas concentraciones de metales disueltos en DAM pueden tener un efecto devastador en ecosistemas acuáticos como terrestres por la disminución de diversas especies.

Procesos de remediacion ambiental basados en la produccion de sulfuro de hidrogeno por BSR, constituyen una alternativa para la remocion de sulfato y la precipitacion de metales pesados². Este bioproceso anaerobico, bien conocido en biotecnologia ambiental, esta basado en la interaccion entre donadores de electrones tales como compuestos organicos (fuentes de carbono), y como aceptor final de electrones al sulfato, para la produccion de sulfuro atraves de la ruta desasimilatoria de sulfato². El sulfuro reacciona con los metales disueltos formando precipitados de sulfuro de metal, y logrando tambien la neutralizacion del agua por produccion alcalina de la oxidacion del donador de electrones en bicarbonato².

Las BSR son anaerobias y utilizan iones de sulfato como un aceptor final de electrones para el metabolismo de sustratos orgánicos (Ecuación No. 1). Aunque una pequeña cantidad de azufre en forma reducida es asimilada por la bacteria, pero en mayor cantidad es liberado como ión sulfuro, el mismo que se combina con metales pesados divalentes presentes en el (Ecuación No. 2)³.

En la actualidad, tiene mayor interés el uso de piscinas de precipitación naturales o artificiales que utilizan el proceso biológico de la reducción de sulfatos, debido a que este método es generalmente de bajo costo y de bajo mantenimiento técnico⁴. Sin embargo se precisa tener consorcios microbianos capaces de soportar condiciones acidas (acidófilos), presentes en los DAM.

Bacterias capaces de producir sulfuro pueden utilizar macromoléculas o productos de fermentación de materia orgánica como donador de electrones. Los residuos celulosicos/hemicelulosicos y ácidos grasos volátiles resultan de la degradación de materia orgánica sólida y constituyen en una alternativa para la donación de electrones tradicionalmente empleados. (ej. Etanol, metanol, glicerol, ácido láctico, ácido acético)².

La columna de Winogradsky ha sido usada para enriquecer diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios, observando el proceso evolutivo y de adaptación a diferentes ambientes y nutrientes. Una vez establecida la columna se facilita el desarrollo de una serie de comunidades relacionadas con la concentración de oxigeno, nutrientes, pH y luz; comunidades bien visibles por sus diferentes colores. De esta manera se obtienen inóculos listos para cultivo de enriquecimiento y posterior establecimiento de cultivos puros, dependientes de diversos factores tanto físicos (temperatura, pH) como químicos (nutrientes)⁵.

El presente trabajo fue llevado a cabo con la finalidad de:

1. Enriquecer las muestras mediante el establecimiento de columnas de Winogradsky, en las cuales se obtuvo una región sulfato reductora en condiciones ácidas.
2. Establecer cultivos batch de consorcios de BSR utilizando diferentes fuentes de carbono en condiciones ácidas para la producción de sulfuro biogénico capaz de precipitar metales pesados.

 

MATERIALES Y METODOS

Toma de Muestras

Las muestras fueron colectadas de diferentes regiones del altiplano Boliviano, tal y como están descritas en la Tabla No. 1. Estas consistieron en lodo negro o agua, que fueron colectadas en envases plásticos de 200 mL llenados por completo para mantener bajos niveles de oxigeno.

 

Cultivo de Bacterias Sulfato Reductoras

Columnas de Winogradsky

Para este proceso se utilizo una columna transparente de plástico de 2 L de capacidad. Se añadió papel higienico como fuente de celulosa en el fondo de la columna para permitir la hidrólisis anaerobia. Posteriormente, se añadió lodo muestra o agua (10 cm), sobrenadante de la centrifugacion de lodo mezclado con una fuente de azufre (sulfato de sodio 32 mM) hasta llenar la columna 5 cm antes del borde, para permitir la transferencia de oxigeno. Finalmente, la columna fue sellada con un film plastico transparente y fue colocada en una zona fresca bien iluminada. El establecimiento de las columnas fue durante un periodo de 5 semanas (Figura No. 2).

 

Medios de Cultivo

Se utilizaron dos medios de cultivo para Bacterias Sulfato Reductoras.

Postgate C modificado: 0.5 g KH₂PO₄, 4.5 g Na₂SO₄, 1 g NH₄Cl, 0.06 g MgSO⁴•7H₂O, 0.06 g CaCl₂•6H₂O, 0.3 g citrato de sodio, 0.004 g FeSO₄•7H₂O, H₂O destilada c.s.p. 1L [10].

Pfennig modificado: Solucion 1: 3 g Na SO₄, 1.2 g NaCl, 0.3 g KCl, 0.4 g MgCl, 0.3 g NH₄Cl, 0.2 g KH₂PO₄, 0.15 g CaCl₂•2H₂O, H₂O destilada 970mL. Solucion 2: 1.5 g FeCl₂•4H₂O, 60 mg H₃BO₃, HCl (25%) 6.5 mL, 120 mg CoCl₂•6H₂O, 70 mg ZnCl², 15 mg CuCl²•2H₂O, H₂O destilada 993mL. Solucion 3: 3 mg Na²SeO₃, 0.5 g NaOH, H₂O destilada 1L. Solucion 4: 8.5 g NaHCO₃, H₂O destilada 100 mL. El medio consiste en 970mL de la solucion 1, 1mL de solucion 2, 1mL de solucion 3 y 30mL de solucion 4 [10].

Tanto al medio Pfennig como al Postgate se añadio solucion de vitaminas al 0,1% y cisteina 0,1% en condiciones anoxicas.

Aislamiento Primario

Cultivos batch en viales de 100 ml fueron establecidos en condiciones anaerobicas utilizando nitrógeno libre de oxigeno, cerradas con tapones de goma y anillas de aluminio. Se probaron diferentes fuentes de carbono, a diferente pH con cada una de las muestras.

Se utilizó celulosa (papel higienico 28,5 g/L), metanol (1%), etanol (1%), glicerol (1%), ac lactico (1%), ac acetico (1%) y acidos grasos volatiles totales (AGVTs, 1.5 mM), como fuentes de carbono para cada una de las muestras ensayadas (inoculadas al 2 %) y se establecieron los cultivos anaerobicos a temperatura ambiente (14-19 ºC) y 37 ºC por el lapso de 1 mes.

Aislamiento Secundario

Cultivo en tubos Roller - Cultivo bifásico - Aislamiento en placa

Se establecieron cultivos sólidos en tubos Roller, donde el agar contiene al inoculo y se solidifica en las paredes del tubo.

Los cultivos bifasicos fueron preparados en tubos con un lecho de agar y una fase liquida de caldo de cultivo, este ultimo para facilitar el enriquecimiento de la muestra.

El aislamiento en placa fue establecido en jarras Gas Pack con atmosfera saturada de CO₂.

En todos los casos se utilizo el medio Postgate modificado con la correspondiente fuente de carbono.

Encapsulacion en perlas de agar-agar

La Encapsulación en perlas de agar-agar permite proteger a las bacterias del pH extremo (condiciones acidas) que puedan presentar los efluentes mineros.

Se procedió a mezclar una dilucion de la suspensión bacteria con agar-agar (3.3% mantenido a 45 ºC) en una proporcion de 4:6. La mezcla fue dispersada con una jeringa (aguja 27G) sobre vaselina liquida en baño de hielo.

Determinaciones analíticas

Determinación de sulfuro

La determinación de sulfuro se realizo por dos métodos uno cualitativo y otro cuantitativo:

Ensayo en acetato de plomo. Es un ensayo cualitativo para la producción de sulfuro. Papel filtro fue humedecido en una solución de acetato de plomo, la fase gaseosa fue tomada empleando una jeringa y esparcida sobre el papel filtro embebido en acetato de plomo, en el cual presenta una coloración marrón metálica que nos indica la presencia de sulfuro de plomo².

Método Turbidimetrico. El sulfuro disuelto en el medio de cultivo fue medido empleando el metodo turbidimetrico reportado por Cord Ruwisch⁹, que se basa en la precipitación de sulfuro de cobre.

 

RESULTADOS Y DISCUSION

Para las columnas de Winogradsky se utilizaron muestras provenientes de la región de Poopo, estas columnas fueron incubadas a temperatura ambiente por un periodo de cinco semanas aproximadamente, en las cuales se observó la separación por fases, en la que la parte inferior pertenece a la región sulfato reductora (color negro). De ésta última se tomo una muestra y se la repico en los medios Postgate y Pfennig con diferentes fuentes de carbono. La Figura No. 3 muestra el desarrollo de los micro-ecosistemas en las columnas. Se puede evidenciar la diferencia de color y claramente la parte profunda demuestra actividad sulfato reductora por la formación de precipitado negro de sulfuro ferroso.

 

En la Tabla No. 1 se detalla la produccion de sulfuro de hidrogeno por consorcios crecidos en diferentes medios de cultivo. Los consorcios SA7 y Go2 presentaron una concentración alta de sulfuro en etanol y glicerol como fuentes de carbono a pHs extremos. Sin embargo es importante resaltar que la produccion de sulfuro de hidrogeno por el consorcio MM10 a partir de la utilización de AGVs como fuente de carbono a un pH de 4, favoreceria el futuro establecimiento de sistemas de remediación de metales pesados en DAMs aprovechando el proceso de digestión anaerobica de la materia organica (residuos solidos municipales y/o agrícolas)². Sin embargo el hecho de utilizar vitaminas en el medio encareceria el sistema de biorremediacion.

En la Tabla No. 2 se muestra que en el medio Pfennig se presenta concentraciones de sulfuro de hidrogeno que pueden ser aprovechadas principalmente en celulosa por los consorcios Soc a pH 6 y Mr a pH 4, ya que representa una fuente de carbono económica para el proceso de biorremediación, pero teniendo como desventaja que la composición de este medio por si solo encarece el proceso. De igual manera pueden ser aprovechables los AGVs, los mismos que pueden ser obtenidos a partir de la digestión anaeróbica de la materia orgánica. En este sentido, el consorcio Soc crecido a pH 4 constituye una excelente alternativa para el establecimiento de procesos de remediación en un solo paso.

 

Por otra parte en el medio Postgate que presenta una menor cantidad de sales puede llegar a abaratar el proceso de biorremediación, así podemos decir que seria muy bien aprovechados los consorcios Lodo (pH6) y Mr (pH4) con celulosa, y Soc y lodo (ambos a pH6) para AGVs, respectivamente.

En ambos medios de cultivo se obtuvo muy buenas concentraciones de sulfuro utilizando como fuente de carbono etanol, pero debemos tomar en cuenta que esta fuente de carbono elevaría los costos para la biorremediación.

Trabajos anteriores muestran concentraciones de 1mM [6] hasta 18mM [2], por lo que nuestra producción de sulfuro se encuentra dentro de concentraciones óptimas para la precipitación de metales pesados.

No se llegaron a aislar cepas de BSR, por lo que se utilizaron directamente los consorcios de BSR, y tomando en cuenta las concentraciones mas altas en cuanto a la producción de sulfuro para proceder a encapsular en perlas de agar-agar.

Conociendo ya estos resultados, se pretende obtener concentraciones mas adecuadas y a la vez optimizar el crecimiento bacteriano. De esta manera se podrían establecer biorreactores en un solo paso que permitan la precipitación eficiente de metales pesados, alcalinizar el pH del efluente y disminuir la concentración de sulfatos del mismo. Asi también se dará protección al consorcio frente a la acidez extrema del DAM, atraves de la encapsulación en perlas de agar-agar, las cuales se encontrarán al interior del biorreactor.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen especialmente el soporte económico recibido de ASDI/SAREC - Suecia en el desarrollo del Proyecto Biodiversidad Microbiana del Lago Poopo y Rio Desaguadero.

Internacional Foundation for Science es también reconocida con gratitud apoyo financiero en la ejecución del presente trabajo.

El apoyo financiero en la formación de “Jóvenes Equipos” del instituto para el desarrollo de la investigación I.R.D (Institut de recherche pour le développement) es también especialmente reconocido.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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4. Kaksonen A., Plumb J., Franzmann P., Puhakka J., Simple organic electron donors support diverse sulfate-reducing communities in fluidized-bed reactors treating acid metal-and sulfate-containing wastewater, FEMS Micribiology Ecology, 2004; 47: 279-289.        [ Links ]

5. Madigan, Martinko, Parker, Biology of Microorganisms, 9ª edicion, ED. Prentice Hall, USA, 2000.        [ Links ]

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10. Widdel F., Bak F., The prokariotes, 2a ed. New York, Springer-Verlag, 1992.        [ Links ]