ARTICULO ORIGINAL

 

CLONACIÓN DEL GEN 633 Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UNA NUEVA DELESIÓN SIL- 633

 

 

Amaru R^I, ; Rambaldi A^II,Biondi A^III
IUniversidad Mayor de San Andrés, Facultad de Medicina, Departamento de Ciencias Funcionales. Unidad de Biología Celular, Bolivia
^IIUniversidad Milano- Bicocca, Instituto Tettamanti, Laboratorio Paolo Belli, Italia
^III Universidad Milano- Bicocca, Instituto Tettamanti, Laboratorio Paolo Belli, Italia

 

 

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RESUMEN

Se identificó un nuevo gen asociado a una nueva delesión durante la pesquisa para la identificación de la delesión de Tal 1. La paciente 633 presentó una banda de 5.5 kb, diferente a las descritas por estudios anteriores. Posteriormente con la técnica 3’RACE se identificó dos nuevas secuencias unidas al exon 1b del gen Sil, el primero fue llamado 633 isoforma A y el segundo 633 isoforma B, ambos genes fueron amplificados a partir de una librería-cDNA. Con L-DNA-PCR y Nested L-DNA-PCR; posteriormente se determinó la nueva delesión entre los genes Sil y 633. Además se determinó la localización del gen 633 sobre el locus 1p32 realizando experimentos en YAC-DNA.

Palabras clave: Sil, Tal1, 633, LLA-T, gen, delesión, clonación.

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ABSTRACT

During the screening with southern blot for Tal 1 deletion, 633 patient presented a band of 5.5 kb, differently to described by previous studies. 3’ RACE was identified two new sequences joined to exon  1b of the Sil gene: 633 gene isoform A and 633 isoform B, both genes were amplified from a Library-cDNA. L-DNA-PCR and Nested L-DNA-PCR, was determined the new break point and the new deletion Sil-633. The location of the 633 gene was determined on the locus 1p32.

Keywords: Sil, Tal1, 633, T-ALL, gene, deletion, cloning.

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INTRODUCCION

La identificación y la clonación de los genes que intervienen en el mecanismo de regulación de la proliferación y diferenciación celular de las leucemias posibilitaron nuevas alternativas terapéuticas con bases moleculares concretas. Por ejemplo los genes BCR y ABL que intervienen en la traslocación t(9;22), forman una proteína quimérica BCR-ABL con actividad tirocinkinasa causante de la leucemia mieloide crónica ^(1,2,3); la identificación de este daño molecular posibilitó la producción de una proteína inhibidora de la tirocinkinasa BCR-ABL, el imatinib (Glivec) utilizado actualmente en el tratamiento de la leucemia mieloide crónica ⁽⁴⁾. El gen TAL-1 (T-cell acute leukemia) es vital para la hematopoyesis, esta localizado en el locus 1 p32 y constituido por 8 exones ^(5,6) que codifican dos isoformas de proteínas con dominio de helix-loop-helix ^(7,8). El gen SIL (SCL interrumpting locus) es responsable de la regulación de la embriogénesis, esta localizado en el locus 1p32 con 18 exones (9) que codifican una proteína reguladora ⁽¹⁰⁾. La delesión del gen TAL1 es una delesión molecular "no ramdom" de 90 Kb presentes en el 20% de leucemias linfoblásticas agudas -T ⁽¹¹⁾, que forma un RNA quimérico SIL-Tal 1 ⁽¹²⁾. Fueron reportados diferentes tipos de delesiones del TAL1 ^(13.14.15) mediadas por el sistema RSS (recombination signal sequences) ⁽¹⁶⁾. En el presente trabajo se describe la caracterización molecular del gen 633 y una nueva delesión SIL-633.

 

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudió material genético de la paciente 633 con diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda T.

Extracción de DNA

Las células mononucleadas de la médula ósea fueron utilizadas para la extracción del DNA con la técnica clásica de digestión con proteinasa k (0.2 mg/ml) incubado a 37 °C por 12 h, luego separados con fenol- cloroformio y precipitado en etanol. Las muestras de DNA se conservaron en solución TE a 4°C hasta su procesamiento.

Extracción de RNA

La extracción del RNA se realizó a partir de células mononucleadas con el método guanidio-isotiocianato ⁽¹⁷⁾, cuantificado por espectrofotómetro UV y cualificado en gel de agarosa al 1%. Las muestras se conservaron en agua libre de RNA asa y congelados a -20°C.

Southern blot

Diez µg de DNA de alto peso molecular fueron digeridas con Hind-lll, EcoR-l, y Bgl-ll (BRL, USA); separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8%, seguido de desnaturalización con solución alcalina y transferida a membrana Gene Screen (GeneScreenPlus-USA). La hibridación se realizó con las sondas SILDB y TALBD2 (concedido por el Prof. JJ van Dongen, Holanda) marcando con 32P y autoradiografiado de acuerdo a métodos descritos ⁽¹⁸⁾.

Northern blot

Diez µg de RNA fueron separadas en gel de Formaldehyde-agarose y transferidos a membrana genescren (GeneScrenplus, USA), seguido de desnaturalización y fijados en calor. La hibridización se realizó con la sonda 633 (segmento del gen 633) marcado con 32P⁽¹⁹⁾

DNA-PCR

El DNA-PCR se realizó utilizando 0.1 ng de DNA con Kits de Perkin Elmer (USA) y primers específicos: sildb, tahdbi, tal1db2, tal1db3, tal1db4 y tal1db5. La amplificación se realizó con un ciclo a 94°C por 3min; 35 ciclos a 94°C por 30 seg, a 64°C por 60 seg y 72°C por 60 seg; y un ciclo a 72°C por 10 minutos. Los productos amplificados fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 2 %.

3’ RACE-PCR (Rapid Amplification of 3 cDNA Ends)

La primera amplificación del cDNA fue realizado con el primer 5' GCGACCCCAACGTCCCAGAG (exon 1 del gen SIL) y el primer 3' (oligo adaptador del kit), amplificado con 40 ciclos a 94°C por 30 segundos, a 60°C por 30 seg. y 72°C por 60 seg. El producto fue fraccionado en gel de agarosa al 1% y purificado con el kit geneclean ( BIO 101, USA)

La segunda amplificación fue realizado con primer 5' TCCTACCTGCAAACAGACCT3 (exon 1b del gen SIL) y primer 3'(oligo adaptador AP1 del kit). El producto de la segunda amplificación fue subclonado en vector pMos (Amersham, Buckinghamshire), posteriormente secuenciado por técnica manual y automática.

L-DNA-PCR (Long DNA- PCR)

La primera amplificación del L-DNA-PCR se realizó con primer 5' GCGACCCCAACGTCCCAGAG (exon 1 del gen SIL) y primer 3" TGCAGCCTTGATCTCCT GCAGTC (N3R633 obtenido de la secuencia identificada con el 3'RACE).

El producto del PCR fue amplificada por segunda vez empleando 5'primer Sildb (Breit et al, 1993)) y el primer 3" TTTGTAGAGACAGAGCCTCCCTA (N3R633N3). Ambas amplificaciones fueron realizadas con 12 ciclos a 94°C por 15 seg, a 56°C por 30 seg, a 72°C por 3 min; y 20 ciclos a 94°C por 30 seg, a 56°C por 30 seg, a 72°C por 3 min. El producto fue separado mediante electroforesis con gel de agarosa al 1%, posteriormente subclonado en pBluscript en dos clones: BP5 de 2Kb y BP6 de 3.4 Kb, la digestión se realizó con Ndel, EcoR-l, Bg I-I I y Pst-I.

Screening de librería de cDNA

A partir de la librería de cDNA de Clonotech fue amplificado el gen 633 isoforma A con 5' primer CCTTCTTGAAGACTTCATAGCAGGCCAAGC (3R7-5’) y primer 3' GTTCAAGTCCTGTGG ACCCCCG (N3R633-3'); para la isoforma B con primer 5' CCTTCTTGAAGACTT CATAGCAGGCCAAGC (3R7-5) y primer 3" GAGAAGGAGTCTCGCTCTATCGC (3R6-3’); ambas isoformas fueron amplificadas con: un ciclo a 94°C por 1 min; 5 ciclos a 94°C por 30 seg, a 70°C por 30 seg; 30 ciclos a 94°C por 30 seg, a 68°C por 4 min.

El SemiNested PCR para ambas isoformas se realizó con primer 5' TTTGAGAGGGA GGATCACTTGAGCCCAGGA (3R8-5) y los primer 3' los mismos de la primera amplificación para ambas isoformas; la amplificación se realizó con un ciclo a 94°C por 5 min, 40 ciclos a 94°C por 30 seg, a 60°C por 30 seg, a 72°C por 1 min; y un ciclo a 72°C por 10 min.

Screening de la librería YAC

Screening de la librería YAC (DIBIT, Milano, Italy) se realizó con PCR usando primer 5' GCATGTGAGTCAGAAAGTTAGGTA (YN-5’) y primer 3' GGCAGAGGTTTTCGGGG-GTCCACA (BP-Z3’). Se amplificó con un ciclo de 94°C por 4 min; 30 ciclos a 94°C por 30 seg, a 68°C por 30 seg, y a 68°C por 4 min.

Secuencia del DNA

Los diferentes segmentos clonados en plásmido fueron secuenciadas manualmente con el Kit-secuencing de Promega y posteriormente fueron clonados por método automático. El primer usado para la secuencia del gen quimérico Sil-633 fue: Sil exon 1b 5’ y para la secuencia del gen 633 se emplearon los siguientes primers: Sil exon 1b5’, N3R633-5’, N3R633N-3’ y N3R633-3' ^(20,21).

 

RESULTADOS

Identificación de una nueva recombinación SIL- 633

Durante el screnning con southern blot el paciente 633 presentó una banda de 5.5 kb, diferente a las descritas por estudios anteriores (Figura 1). El resultado anterior fue confirmado con un segundo experimento.

Identificación de una nueva secuencia nucleotidica unida al gen SIL

Con la técnica 3'RACE se identificó dos nuevas secuencias unidas al exon 1b del gen Sil, el primero fue llamado 633 isoforma A y el segundo 633 isoforma B (Figura 2)

Identificación del gen 633 isoforma A y B en librería de cDNA

De la librería Clontech (cDNA) se amplificó el gen 633 isoforma A (190 bp) y 633 isoforma B (240bp), además de una banda desconocida a 120 bp. (Figura 3)

Caracterización genómica de la nueva delesión SIL-633

Con L-DNA-PCR y Nested L-DNA-PCR, se amplificó el DNAdel paciente 633 obteniéndose una banda de 5.4 Kb, posteriormente subclonado en dos fragmentos: BP5 y BP6. En la secuencia de BP5 se identificó el exon 1b del gen Sil, el intron 1b del Sil, el nuevo breakpoint y el intron del gen 633. En la secuencia de BP6 se identificó el intron del gen 633 y el exon del gen 633. (Figura 4)

Identificación de la localización del gen 633

En los clones 810E8 y 810G12 de la librería YAC-DNA genómico, se amplificó el gen 633, junto a los genes Sil y Tal 1; los tres genes fueron negativos para los clones 820D11, 952E4 Y810E12; confirmándose la localización del gen 633 en el locus 1p32 entre el aen Sil y Tal1 (Figura 5)

 

DISCUSION

Con los resultados de southern blot y PCR se identificó un nuevo break point en la región del intron comprendida entre los genes Sil y 633 a 16 kb del gen Tal1. La amplificación del cDNA del paciente 633 demostró que el primer exon del gen Sil tiene como patner una nueva secuencia; para demostrar la real existencia de este gen se realizó un northern blot usando como sonda el gen 633 y se observó una banda de 300 bp; además se amplificó el gen 633 a partir de la librería comercial (cDNA) Clonotech.La nueva delesión Sil-633 esta comprendida entre el intron del exon 1b del gen Sil y el intron del gen 633, la delesión corresponde aproximadamente a 70 Kb.

AGRADECIMIENTOS

A la Asociación Paolo Belli de Italia, Laboratorio Paolo Belli de Italia, Instituto Tettamanti de la Universidad Milano-Bicocca.

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